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Alt 17.02.2006, 10:49   #1   Druckbare Version zeigen
Ragi weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 7
Phenol-Chloroform extraction

Hallo,

Isoliere mal wieder genomische DNA. Jetzt muss ich das nach der "alten" Methode machen, d.h. eine Phenol-Proteinase K extraction. Der Ablauf ist mir soweit auch klar, aber jetzt soll ich, in einem Zwischenschritt, durch Chloroform das Phenol loswerden. Kann mir da mal jemand sagen, wie man das macht und auf was ich da achten muss. Waere auch ueber Internetseiten zu diesem Thema dankbar.

Vielen Dank
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Alt 18.02.2006, 12:28   #2   Druckbare Version zeigen
ehemaliges Mitglied  
nicht mehr Mitglied
Beiträge: n/a
AW: Phenol-Chloroform extraction

Hört sich nach DNA-Extraktion aus Gram-neg. an.
Also nach der Phenol-Ex. hast Deine DNA ja in einer wässrigen Lösung vorliegen
die noch mit Phenolresten kontaminiert ist, normalerweise gibt man dann das
gleiche Volumen Chloroform dazu, vorsichtig umschwenken oder rollern bis sich
die beiden Phasen gut durchmischt haben, dann abzentrifugieren, in der oberen
wässrigen Phase ist die DNA drin.
Sollte diese Lösung dann noch nach Phenol riechen die Prozedur wiederholen.
Bezüglich des Chloroforms: mittlerweile nehm ich einfach p.a.-Chloroform, hab
das aber auch schon mit TE-equilibriertem Chloroform machen müssen, obwohl
ich echt nicht weiß warum das TE einen Einfluß drauf haben soll, das dürfte
sich nämlich gar nicht im Chloroform lösen.

Tschö,
Helli

Edit: ich hab hier noch das Protokoll rausgesucht das ich selbst mittlerweile verwende:

Neumann, Pospiech, Schairer
Rapid isolation of genomic DNA from gram-negative bacteria
Trends in Genetics (1992) 8, 332-333

Hier macht man einen Aufschluß mit Prot. K und SDS, gibt größere Mengen NaCl hinzu die
den Zellschrott ausfällen und extrahiert das ganze mit Chloroform. Dabei bildet sich an der
Phasengrenze eine viel massivere Schicht an Zelldebris als bei der Phenolextraktion, was
die Entnahme der oberen DNA-Phase ungemein erleichtert. Das NaCl geht eigentlich auch
ganz gut wieder bei der EtOH-Fällung raus, ich fisch das ausgefällte DNA-Gewölle mit einem
Glashaken (-> Pasteurpipette) aus der Lösung und wasch das noch zweimal mit 70% EtOH.
Für PCR und Southerns reicht das zumindest.

Geändert von helljoy (18.02.2006 um 12:56 Uhr)
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