Wenn du das wirklich schon eine Zeit lang machst und es einfach nicht klappt, würde ich die Sache systematisch angehen und ein paar Kontrollen mit einbauen.
Noch bevor du irgendwas an Ligation machst, schaust du dir den geschnittenen Vektor und das geschnittene PCR-Produkt/Insert auf dem Agarose-Gel an. Hast du da vernünftige Mengen, die du siehst? Eine DNA-Bestimmung per Nanodrop ist nie so wirklich toll und ich würde immer erst die Sachen auf dem Gel sehen wollen, selbst wenn du in der Gelextraktion immer Material verlierst. Dabei siehst du zumindest auch beim leeren Vektor, ob dein Restriktionsenzym noch vernünftige Aktivität hat. Und du hast später zumindest eine Idee, was du auf einem Gel der Ligation maximal erwarten kannst.
Dann machst du eine Gelextraktion und pipettierst de Ligation zusammen. Den Tipp mit dem ATP hast du schon bekommen. Ich aliquotiere mir immer ein neues Tube Ligationspuffer, um ständiges Einfrieren und Auftauen zu vermeiden. Wenn du die Möglichkeit nicht hast, kannst du natürlich auch ein bisschen frisches ATP zugeben.
Auch wenn die meisten Hersteller sagen, dass die Ligation nur 5-10 min dauert, würde ich 1-2 Stunden bei Raumtempertur inkubieren. Dann nimmst du ein bisschen was für eine Trafo in Bakterien und lässt den Rest der Ligation über Nacht im Kühlschrank stehen. Falls die erste Trafo nichts bringt, kannste am nächsten Tag die Ligation aus dem Kühlschrank erneut Transformieren.
Bei der Transformation solltest du dich ans Protokoll halten. Als Problemquellen würde ich sagen, dass deine kompetenten Bakterien nicht mehr in Ordnung sind oder etwas mit deinen Agarplatten falsch läuft.
Nehmen andere Leute bei euch die gleichen kompetenten Zellen? Funktionieren sie bei denen? Ich hatte schon alte kompetente Zellen, bei denen max. 2-3 Kolonien gewachsen sind; am nächsten Tag mit frischen Zellen hatte ich hunderte Kolonien, aus der gleichen Ligation!
Eher um Fehler/Verwechslungen auszuschließen würde ich auch noch mal das betreffende Antibiotikum frisch ansetzen und damit frisch Platten gießen. Es kann halt mal vorkommen, dass jemand eine Stammlösung falsch angesetzt hatte, das falsche Antibiotikum in den Platten ist o.ä.
Den Transformations-Teil kannst du zumindest etwas testen, indem du mal ein fertiges Plasmid mit bekannter Resistenz mitlaufen lässt. Wenn nach der Re-Transformation nichts wächst, sind entweder die Platten oder die Bakterien kaputt, oder du machst etwas grundlegend falsch.
Am wichtigsten finde ich aber, dass man bei solchen Problemen einfach mal komplett neu startet. Also nicht mit altem PCR-Produkt und schonmal geschnittenen Plasmid arbeitet, sondern einfach neu startet. Meist klappt es dann auch.
Viel Erfolg,
Zara
Linear-Darstellung
