Biologie & Biochemie
Buchtipp
Genetik für Ahnungslose
M. Aubele
19,80 €

Buchcover

Anzeige
Stichwortwolke
forum

Zurück   ChemieOnline Forum > Naturwissenschaften > Biologie & Biochemie

Hinweise

Biologie & Biochemie Ein Forum für Molekularbiologie, Genetik, Gentechnik und andere biologische sowie biochemische Themen.

Anzeige

Antwort
 
Themen-Optionen Ansicht
Alt 13.06.2017, 12:35   #1   Druckbare Version zeigen
mina1990  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 8
Probleme mit Ligation

Hallo,


Ich versuche schon seit einer Weile ein Insert über einen Vektor in Ecoli zu clonieren.
Zunächst hatte ich mein Insert mit BamH1 verdaut und auch das Plasmid entsprechend verdaut und gecippt und versucht zu ligieren. Nach der folgenden Trafo ist aber nichts auf den Platten gewachsen. Also habe ich aus Interesse die Ligation mal aufs Gel aufgetragen, um zu sehen ob und was überhaupt dort passiert ist. Das Gelbild war allerdings leer. Ich hab aber definitiv alles zusammen pipettier, jeweils die Konz gemessen und entsprechende Mengen eingesetzt.
Hatte das Problem schonmal jemand? Oder kann mir jemand tips geben? ich verstehe einfach nicht, wie in der Ligation sowohl Insert als auch Plasmid verschwinden.
Ich weiß, dass das nach Pipettierfehler schreit - aber ich habe wirklich alles normal zusammen pipettiert. Genutzt habe ich die T4 Ligase & Puffer.


Ich danke für eure Antworten!
mina1990 ist offline   Mit Zitat antworten
Anzeige
Alt 13.06.2017, 15:41   #2   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
Mitglied
Beiträge: 7.294
AW: Probleme mit Ligation

Vielleicht war einfach nur das ATP im Ligasepuffer kaputt. Mach Kontrollexperimente, obs an BamHI oder am Rest des Ansatzes liegen könnte. Probiers mit einem anderen Hersteller. Was evtl. auch helfen kann, ist eine Phenol-Chloroform-Extraktion nach dem Verdau, verschiedene Vektor:Insert Ratios oder auch einen Teil des Ansatzes unligiert zu transformieren (E. coli kann auch selber reparieren).

Zum Gelbild: Eigentlich sollte man, hinreichende Mengen DNA vorausgesetzt, wenigstens irgendwas auf dem Gel sehen. -> DNAse im System? Vielleicht so testen: Plasmid mit was anderem linearisieren und dann die einzelnen Komponenten der Ligation zusetzen und auf dem Gel gucken, ob DNAseaktivität beobachtet wird.
__________________
I solemnly swear that I'm up to no good!
伍佰 (WuBai - Run run run!) (ein Musikvideo mit dem Bambushaus und dem imalipusram unter den Statisten)
Noch ein nettes Video (nerdy, ein LIHA-Robot)
Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.
imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 13.06.2017, 16:22   #3   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.719
AW: Probleme mit Ligation

Wenn du das wirklich schon eine Zeit lang machst und es einfach nicht klappt, würde ich die Sache systematisch angehen und ein paar Kontrollen mit einbauen.

Noch bevor du irgendwas an Ligation machst, schaust du dir den geschnittenen Vektor und das geschnittene PCR-Produkt/Insert auf dem Agarose-Gel an. Hast du da vernünftige Mengen, die du siehst? Eine DNA-Bestimmung per Nanodrop ist nie so wirklich toll und ich würde immer erst die Sachen auf dem Gel sehen wollen, selbst wenn du in der Gelextraktion immer Material verlierst. Dabei siehst du zumindest auch beim leeren Vektor, ob dein Restriktionsenzym noch vernünftige Aktivität hat. Und du hast später zumindest eine Idee, was du auf einem Gel der Ligation maximal erwarten kannst.

Dann machst du eine Gelextraktion und pipettierst de Ligation zusammen. Den Tipp mit dem ATP hast du schon bekommen. Ich aliquotiere mir immer ein neues Tube Ligationspuffer, um ständiges Einfrieren und Auftauen zu vermeiden. Wenn du die Möglichkeit nicht hast, kannst du natürlich auch ein bisschen frisches ATP zugeben.
Auch wenn die meisten Hersteller sagen, dass die Ligation nur 5-10 min dauert, würde ich 1-2 Stunden bei Raumtempertur inkubieren. Dann nimmst du ein bisschen was für eine Trafo in Bakterien und lässt den Rest der Ligation über Nacht im Kühlschrank stehen. Falls die erste Trafo nichts bringt, kannste am nächsten Tag die Ligation aus dem Kühlschrank erneut Transformieren.

Bei der Transformation solltest du dich ans Protokoll halten. Als Problemquellen würde ich sagen, dass deine kompetenten Bakterien nicht mehr in Ordnung sind oder etwas mit deinen Agarplatten falsch läuft.
Nehmen andere Leute bei euch die gleichen kompetenten Zellen? Funktionieren sie bei denen? Ich hatte schon alte kompetente Zellen, bei denen max. 2-3 Kolonien gewachsen sind; am nächsten Tag mit frischen Zellen hatte ich hunderte Kolonien, aus der gleichen Ligation!
Eher um Fehler/Verwechslungen auszuschließen würde ich auch noch mal das betreffende Antibiotikum frisch ansetzen und damit frisch Platten gießen. Es kann halt mal vorkommen, dass jemand eine Stammlösung falsch angesetzt hatte, das falsche Antibiotikum in den Platten ist o.ä.
Den Transformations-Teil kannst du zumindest etwas testen, indem du mal ein fertiges Plasmid mit bekannter Resistenz mitlaufen lässt. Wenn nach der Re-Transformation nichts wächst, sind entweder die Platten oder die Bakterien kaputt, oder du machst etwas grundlegend falsch.

Am wichtigsten finde ich aber, dass man bei solchen Problemen einfach mal komplett neu startet. Also nicht mit altem PCR-Produkt und schonmal geschnittenen Plasmid arbeitet, sondern einfach neu startet. Meist klappt es dann auch.

Viel Erfolg,
Zara
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
Anzeige


Antwort

Stichworte
gel negativ, ligation, probleme

Themen-Optionen
Ansicht

Gehe zu

Ähnliche Themen
Thema Autor Forum Antworten Letzter Beitrag
Ligation flockt aus Minii Biologie & Biochemie 11 08.07.2014 23:00
Puffersystem von Ligation yasin111 Biologie & Biochemie 4 14.06.2010 04:05
Ligation Peavy Biologie & Biochemie 5 02.10.2009 11:19
Ligation Problem Hipp Biologie & Biochemie 7 05.11.2008 08:51
Ligation Problem Hipp Biologie & Biochemie 1 03.11.2008 19:48


Alle Zeitangaben in WEZ +2. Es ist jetzt 20:43 Uhr.



Anzeige