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Alt 25.05.2011, 18:28   #1   Druckbare Version zeigen
chemoholic  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 11
DNA Isolation - Warum wird Chloroform verwendet und warum nutze ich Ethanol und Isopropanol?

Hallo,

wir haben im Biochemie-Praktikum DNA aus E.coli Zellen isoliert und sollen nun im Protokoll diskutieren, warum wir welchen Schritt gemacht haben.
Für einige Schritte habe ich im Internet eine Begründung gefunden. Ich hoffe ihr könnt mir bei den restlichen helfen!
Ich habe hier unsere Versuchsanleitung aufgeschrieben und die Begründung bzw. meine Fragen zu den einzelnen Schritten. Ich hoffe, dass ist so übersichtlich.

1. E. coli Kultur wird zu TE-Puffer gegeben und Zentrifugiert
-> Trennung der Bakterien vom vorherigen Medium
2. Zellpellet in TE-Puffer resuspendieren
-> Der TE-Puffer enthält EDTA, welches zweiwertige Metallionen wie Magnesiumionen komplexiert und somit Nucleasen inaktiviert,
außerdem ist Tris enthalten, welches als Puffer dient
6. Unter Schütteln 500 μl SDS-Lösung zugeben
-> SDS lysiert die Zellmembran
7. 5 min auf 65 °C im Wasserbad erhitzen
-> verstärkt die Wirkung von SDS
8. 0,5 ml NaCl-Lösung zugeben und mischen
-> die Natriumionen lagern sich an die DNA an und stabilisiert sie
9. 3 ml Chloroform zugeben und kräftig schütteln
-> Warum? Chloroform soll Proteine denaturieren, aber wie? Außerdem wurde uns gesagt, dass es das SDS von den Proteinen verdrängt und sich so Proteinaggregate bilden
können. Ich verstehe leider nicht, wie das funktionieren soll.
10. 10 min bei 5000 rpm zentrifugieren (RT)
-> Trennung der Proteine von der DNA
11. Die wässrige Phase in ein neues Eppi überführt
-> Die wässrige Phase enthält die DNA.
12. 4 ml Isopropanol zugeben und mischen
-> Ausfällung der DNA
-> Ich habe gelesen, dass Isopropanol alles Wasser der DNA entzieht und somit die Hydrathülle. Ist das richtig?
13. 10 min bei 5000 rpm zentrifugieren (4 °C)
14. Den Überstand vorsichtig dekantieren und gut abtropfen lassen
-> mit beiden Schritten wird die ausgefällte DNA isoliert
15. 2 ml kaltes 70%iges Ethanol zugeben und schütteln
16. 10 min bei 5000 rpm zentrifugieren (4 °C)
-> Ich habe gelesen, dass der Ethanol zur Reinigung da ist, aber wovon wird es gereinigt? Warum nehme ich nicht beides Mal Ethanol?
17. Den Überstand vorsichtig dekantieren und gut abtropfen lassen
-> DNA Isolation
18. Das Pellet ca. 10 min gut trocknen lassen (Röhrchen mit der Öffnung nach unten)
-> Verdampfung des restlichen Ethanols
19. Das Pellet zunächst in 0,2 ml TE-Puffer lösen
-> DNA geht in Lösung und kann weiter verwendet werden.

Vielen Dank für Eure Hilfe!

chemikus
chemoholic ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 28.05.2011, 12:49   #2   Druckbare Version zeigen
Rubisco Männlich
Mitglied
Beiträge: 41
AW: DNA Isolation - Warum wird Chloroform verwendet und warum nutze ich Ethanol und Isopropanol?

Hey,

das mit Chloroform ist relativ banal...
Proteine sind nur funktionell, d.h. richtig gefaltet wenn sie im wässrigen Medium vorliegen! D.h. wenn die Proteine in einem Hydrophoben Lösungsmitteln sind, werden sich die im wässrigen Medium innen liegenden hydrophoben Bereiche nach außen stülpen und die vorher außen liegenden hydrophilen Bereiche nach innen. Wenn du das mal im Detail, also mit Entropie-Überlegungen und so nachvollziehen willst, lies im Stryer über den hydrophoben Effekt nach! Mit dieser Erklärung erübrigt sich auch die Frage mit der SDS-Verdrängung.

Das mit den Alkoholen stimmt so

Cya Rubisco
Rubisco ist offline   Mit Zitat antworten
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chloroform, dna isolation, sds

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